Javascript je aktuálně ve vašem prohlížeči zakázán.Když je javascript zakázán, některé funkce tohoto webu nebudou fungovat.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Katalánsko, Španělsko * Tito autoři mají určité poznatky o této práci Equal pozadí příspěvku: Kyselina hyaluronová (HA) je přirozeně se vyskytující polysacharid používaný při výrobě dermálních výplní pro estetické účely.Vzhledem k tomu, že má v lidských tkáních poločas rozpadu několik dní, jsou dermální výplně na bázi HA chemicky upravovány, aby se prodloužila jejich životnost v těle.Nejběžnější modifikací komerčních plniv na bázi HA je použití 1,4-butandioldiglycidyletheru (BDDE) jako síťovacího činidla pro zesíťování řetězců HA.Zbytkový nebo nezreagovaný BDDE je považován za netoxický při <2 částice na milion (ppm);proto musí být zbytkový BDDE v konečné dermální výplni kvantifikován, aby byla zajištěna bezpečnost pacienta.Materiály a metody: Tato studie popisuje detekci a charakterizaci vedlejšího produktu zesíťovací reakce mezi BDDE a HA za alkalických podmínek kombinací kapalinové chromatografie a hmotnostní spektrometrie (LC-MS).Výsledky: Po různých analýzách bylo zjištěno, že alkalické podmínky a vysoká teplota použité k dezinfekci hydrogelu HA-BDDE podpořily tvorbu tohoto nového vedlejšího produktu, sloučeniny „podobné propylenglykolu“.LC-MS analýza potvrdila, že vedlejší produkt má stejnou monoizotopovou hmotnost jako BDDE, jiný retenční čas (tR) a odlišný mód UV absorbance (A=200 nm).Na rozdíl od BDDE bylo při analýze LC-MS pozorováno, že za stejných podmínek měření má tento vedlejší produkt vyšší rychlost detekce při 200 nm.Závěr: Tyto výsledky ukazují, že ve struktuře této nové sloučeniny není žádný epoxid.Diskuse je otevřená pro posouzení rizika tohoto nového vedlejšího produktu nalezeného při výrobě HA-BDDE hydrogelu (HA dermální výplň) pro komerční účely.Klíčová slova: kyselina hyaluronová, dermální výplň HA, síťovaná kyselina hyaluronová, BDDE, analýza LC-MS, vedlejší produkt BDDE.
Výplně na bázi kyseliny hyaluronové (HA) jsou nejběžnější a nejoblíbenější dermální výplně používané pro kosmetické účely.1 Tento dermální výplň je hydrogel, obvykle složený z >95 % vody a 0,5–3 % HA, což jim dává gelovitou strukturu.2 HA je polysacharid a hlavní složka extracelulární matrix obratlovců.Jedna ze složek.Skládá se z opakujících se disacharidových jednotek kyseliny (1,4)-glukuronové-β (1,3)-N-acetylglukosaminu (GlcNAc) spojených glykosidickými vazbami.Tento disacharidový vzorec je stejný ve všech organismech.Ve srovnání s některými plnidly na bázi proteinů (jako je kolagen) tato vlastnost dělá z HA vysoce biokompatibilní molekulu.Tato plniva mohou vykazovat specifičnost aminokyselinové sekvence, která může být rozpoznána imunitním systémem pacienta.
Při použití jako dermální výplň je hlavním omezením HA její rychlý obrat v tkáních kvůli přítomnosti specifické rodiny enzymů nazývaných hyaluronidázy.Dosud bylo popsáno několik chemických modifikací ve struktuře HA pro zvýšení poločasu rozpadu HA v tkáních.Většina těchto modifikací se pokouší omezit přístup hyaluronidázy k polysacharidovým polymerům zesíťováním řetězců HA.Proto v důsledku tvorby můstků a intermolekulárních kovalentních vazeb mezi strukturou HA a síťovacím činidlem vytváří zesíťovaný hydrogel HA více produktů degradace antienzymů než přírodní HA.4-6
Dosud chemická síťovací činidla používaná k výrobě zesíťovaného HA zahrnují methakrylamid, 7 hydrazid, 8 karbodiimid, 9 divinylsulfon, 1,4-butandioldiglycidylether (BDDE) a poly(ethylenglykol)diglycidylether.10,11 BDDE je v současnosti nejběžněji používaným síťovacím činidlem.Ačkoli se tyto typy hydrogelů po desetiletí prokázaly jako bezpečné, používaná síťovací činidla jsou reaktivní činidla, která mohou být cytotoxická a v některých případech mutagenní.12 Proto musí být jejich zbytkový obsah ve finálním hydrogelu vysoký.BDDE je považováno za bezpečné, když je zbytková koncentrace nižší než 2 částice na milion (ppm).4
Existuje několik metod pro detekci nízkozbytkové koncentrace BDDE, stupně zesítění a polohy substituce v hydrogelech HA, jako je plynová chromatografie, vylučovací chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií (MS), metody měření fluorescence pomocí nukleární magnetické rezonance (NMR) a Vysoce výkonná kapalinová chromatografie s diodovým polem (HPLC).13-17 Tato studie popisuje detekci a charakterizaci vedlejšího produktu v konečném zesíťovaném hydrogelu HA vyrobeném reakcí BDDE a HA za alkalických podmínek.HPLC a kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS analýza).Protože toxicita tohoto vedlejšího produktu BDDE není známa, doporučujeme, aby kvantifikace jeho reziduí byla stanovena podobným způsobem jako metoda obvykle prováděná na BDDE v konečném produktu.
Získaná sodná sůl HA (Shiseido Co., Ltd., Tokio, Japonsko) má molekulovou hmotnost ~1 368 000 Da (Laurentova metoda) 18 a vnitřní viskozitu 2,20 m3/kg.Pro síťovací reakci byl BDDE (>95 %) zakoupen od Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok s pH 7,4 byl zakoupen od Sigma-Aldrich Company.Všechna rozpouštědla, acetonitril a voda použité v LC-MS analýze byly zakoupeny od kvality HPLC.Kyselina mravenčí (98 %) se kupuje jako reagenční čistota.
Všechny experimenty byly prováděny na systému UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) a byly připojeny k trojitému kvadrupólovému hmotnostnímu spektrometru API 3000 vybavenému elektrosprejovým ionizačním zdrojem (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Syntéza zesíťovaných hydrogelů HA byla zahájena přidáním 198 mg BDDE do 10% (hmotn./hmotn.) roztoku hyaluronátu sodného (NaHA) v přítomnosti 1% alkálie (hydroxid sodný, NaOH).Konečná koncentrace BDDE v reakční směsi byla 9,9 mg/ml (0,049 mM).Poté byla reakční směs důkladně promíchána a homogenizována a ponechána probíhat při 45 °C po dobu 4 hodin.19 pH reakce se udržuje na -12.
Poté byla reakční směs promyta vodou a konečný hydrogel HA-BDDE byl zfiltrován a zředěn pufrem PBS pro dosažení koncentrace HA 10 až 25 mg/ml a konečného pH 7,4.Za účelem sterilizace vyrobených zesíťovaných hydrogelů HA se všechny tyto hydrogely autoklávují (120 °C po dobu 20 minut).Purifikovaný hydrogel BDDE-HA se skladuje při 4 °C až do analýzy.
K analýze BDDE přítomného v zesíťovaném HA produktu bylo zváženo 240 mg vzorku a zavedeno do středového otvoru (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; objem 0,5 ml) a centrifugováno při 10 000 ot./min při teplotě místnosti. 10 minut.Bylo shromážděno a analyzováno celkem 20 ul stahovací kapaliny.
Aby bylo možné analyzovat standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) za alkalických podmínek (1 %, 0,1 % a 0,01 % NaOH), jsou při splnění následujících podmínek kapalný vzorek 1:10, 1:100 nebo až 1:1 000 000 V případě potřeby použijte pro analýzu deionizovanou vodu MilliQ.
Pro výchozí materiály použité v síťovací reakci (HA 2%, H20, 1% NaOH a 0,049 mM BDDE) byl 1 ml každého vzorku připraveného z těchto materiálů analyzován za použití stejných analytických podmínek.
Pro stanovení specifičnosti píku objevujících se v iontové mapě bylo k 20 ul vzorku přidáno 10 ul 100 ppb standardního roztoku BDDE (Sigma-Aldrich Co).V tomto případě je konečná koncentrace standardu v každém vzorku 37 ppb.
Nejprve připravte zásobní roztok BDDE o koncentraci 11 000 mg/l (11 000 ppm) zředěním 10 μl standardního BDDE (Sigma-Aldrich Co) 990 μl vody MilliQ (hustota 1,1 g/ml).Tento roztok použijte k přípravě roztoku 110 µg/l (110 ppb) BDDE jako mezilehlého standardního ředění.Poté použijte přechodné standardní ředidlo BDDE (110 ppb) k přípravě standardní křivky několikanásobným zředěním přechodného ředidla, abyste dosáhli požadované koncentrace 75, 50, 25, 10 a 1 ppb.Jak je znázorněno na obrázku 1, bylo zjištěno, že standardní křivka BDDE od 1,1 do 110 ppb má dobrou linearitu (R2>0,99).Standardní křivka byla opakována ve čtyřech nezávislých experimentech.
Obrázek 1 Standardní kalibrační křivka BDDE získaná analýzou LC-MS, ve které je pozorována dobrá korelace (R2>0,99).
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie.
Aby bylo možné identifikovat a kvantifikovat standardy BDDE přítomné v zesíťovaném HA a standardy BDDE v základním roztoku, byla použita analýza LC-MS.
Chromatografické separace bylo dosaženo na LUNA 2,5 um C18(2)-HST koloně (50 x 2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) a během analýzy byla udržována při teplotě místnosti (25 °C).Mobilní fáze se skládá z acetonitrilu (rozpouštědlo A) a vody (rozpouštědlo B) obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí.Mobilní fáze se eluuje gradientovou elucí.Gradient je následující: 0 minut, 2 % A;1 minuta, 2 % A;6 minut, 98 % A;7 minut, 98 % A;7,1 minut, 2 % A;10 minut, 2% A. Doba provozu je 10 minut a injekční objem je 20 µL.Retenční čas BDDE je asi 3,48 minut (v rozmezí od 3,43 do 4,14 minut na základě experimentů).Mobilní fáze byla čerpána průtokovou rychlostí 0,25 ml/min pro analýzu LC-MS.
Pro analýzu BDDE a kvantifikaci pomocí MS je systém UPLC (Waters) kombinován s hmotnostním spektrometrem API 3000 s trojitým kvadrupólem (AB SCIEX) vybaveným elektrosprejovým ionizačním zdrojem a analýza se provádí v režimu pozitivních iontů (ESI+).
Podle analýzy iontových fragmentů provedené na BDDE byl fragment s nejvyšší intenzitou určen jako fragment odpovídající 129,1 Da (obrázek 6).Proto v multiiontovém monitorovacím režimu (MIM) pro kvantifikaci je hmotnostní konverze (poměr hmotnosti k náboji [m/z]) BDDE 203,3/129,1 Da.Pro analýzu LC-MS také používá režim úplného skenování (FS) a režim skenování iontů produktu (PIS).
Za účelem ověření specifičnosti metody byl analyzován slepý vzorek (počáteční mobilní fáze).Ve slepém vzorku s hmotnostní konverzí 203,3/129,1 Da nebyl detekován žádný signál.Pokud jde o opakovatelnost experimentu, bylo analyzováno 10 standardních nástřiků 55 ppb (uprostřed kalibrační křivky), což vedlo ke zbytkové standardní odchylce (RSD) < 5 % (data neuvedena).
Zbytkový obsah BDDE byl kvantifikován v osmi různých autoklávovaných BDDE zesítěných HA hydrogelech, což odpovídá čtyřem nezávislým experimentům.Jak je popsáno v části „Materiály a metody“, kvantifikace je hodnocena průměrnou hodnotou regresní křivky standardního ředění BDDE, která odpovídá jedinečnému píku detekovanému při hmotnostním přechodu BDDE 203,3/129,1 Da, s retencí. čas 3,43 až 4,14 minuty Nečeká se.Obrázek 2 ukazuje příklad chromatogramu 10 ppb BDDE referenčního standardu.Tabulka 1 shrnuje zbytkový obsah BDDE v osmi různých hydrogelech.Rozsah hodnot je 1 až 2,46 ppb.Proto je zbytková koncentrace BDDE ve vzorku přijatelná pro lidské použití (<2 ppm).
Obrázek 2 Iontový chromatogram 10 ppb BDDE referenčního standardu (Sigma-Aldrich Co), MS (m/z) přechod získaný analýzou LC-MS 203,30/129,10 Da (v pozitivním MRM módu).
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí;MS, hmotnost;m/z, poměr hmotnosti k náboji.
Poznámka: Vzorky 1-8 jsou autoklávované BDDE zesíťované HA hydrogely.Uvádí se také zbytkové množství BDDE v hydrogelu a vrchol retenčního času BDDE.Konečně je také uvedena existence nových píku s různými retenčními časy.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;HA, kyselina hyaluronová;MRM, monitorování více reakcí;tR, retenční čas;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;RRT, relativní retenční čas.
Analýza iontového chromatogramu LC-MS překvapivě ukázala, že na základě všech analyzovaných vzorků autoklávovaného zesíťovaného HA hydrogelu byl navíc pík při kratším retenčním čase 2,73 až 3,29 minut.Například obrázek 3 ukazuje iontový chromatogram vzorku zesíťovaného HA, kde se další pík objevuje při odlišném retenčním čase přibližně 2,71 minuty.Bylo zjištěno, že pozorovaný relativní retenční čas (RRT) mezi nově pozorovaným vrcholem a vrcholem z BDDE je 0,79 (tabulka 1).Protože víme, že nově pozorovaný pík je méně zadržen v C18 koloně použité v LC-MS analýze, nový pík může odpovídat polárnější sloučenině než BDDE.
Obrázek 3 Iontový chromatogram vzorku zesíťovaného hydrogelu HA získaného pomocí LC-MS (hmotnostní konverze MRM 203,3/129,0 Da).
Zkratky: HA, kyselina hyaluronová;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí;RRT, relativní retenční čas;tR, retenční čas.
Aby se vyloučila možnost, že nové pozorované píky mohou být kontaminanty původně přítomné v použitých surovinách, byly tyto suroviny také analyzovány pomocí stejné analytické metody LC-MS.Mezi analyzované výchozí materiály patří voda, 2 % NaHA ve vodě, 1 % NaOH ve vodě a BDDE ve stejné koncentraci, jaká se používá při síťovací reakci.Iontový chromatogram použitého výchozího materiálu neukázal žádnou sloučeninu nebo pík a jeho retenční čas odpovídá novému pozorovanému píku.Tato skutečnost zavrhuje myšlenku, že nejen výchozí materiál může obsahovat jakékoli sloučeniny nebo látky, které mohou interferovat s postupem analýzy, ale neexistují žádné známky možné křížové kontaminace s jinými laboratorními produkty.Hodnoty koncentrace získané po LC-MS analýze BDDE a nových píku jsou uvedeny v tabulce 2 (vzorky 1-4) a iontový chromatogram na obrázku 4.
Poznámka: Vzorky 1-4 odpovídají surovinám použitým k výrobě autoklávovaných BDDE zesíťovaných hydrogelů HA.Tyto vzorky nebyly autoklávovány.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;HA, kyselina hyaluronová;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí.
Obrázek 4 odpovídá LC-MS chromatogramu vzorku surového materiálu použitého v síťovací reakci HA a BDDE.
Poznámka: Všechny jsou měřeny při stejné koncentraci a poměru, jaké se používají k provedení síťovací reakce.Čísla pro suroviny analyzované chromatogramem odpovídají: (1) vodě, (2) 2% vodnému roztoku HA, (3) 1% vodnému roztoku NaOH.Provádí se LC-MS analýza pro hmotnostní konverzi 203,30/129,10 Da (v pozitivním MRM módu).
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;HA, kyselina hyaluronová;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí.
Byly studovány podmínky, které vedly k vytvoření nových vrcholů.Aby bylo možné studovat, jak reakční podmínky použité k výrobě zesíťovaného hydrogelu HA ovlivňují reaktivitu zesíťovacího činidla BDDE, což vede k tvorbě nových píku (možných vedlejších produktů), byla provedena různá měření.Při těchto stanoveních jsme studovali a analyzovali finální zesíťovací činidlo BDDE, které bylo ošetřeno různými koncentracemi NaOH (0 %, 1 %, 0,1 % a 0,01 %) ve vodném médiu, s následným nebo bez autoklávování.Bakteriální postup pro simulaci stejných podmínek je stejný jako metoda použitá k výrobě zesíťovaného hydrogelu HA.Jak je popsáno v části „Materiály a metody“, hmotnostní přechod vzorku byl analyzován pomocí LC-MS na 203,30/129,10 Da.Vypočte se BDDE a koncentrace nového píku a výsledky jsou uvedeny v tabulce 3. Ve vzorcích, které nebyly autoklávovány, nebyly detekovány žádné nové píky, bez ohledu na přítomnost NaOH v roztoku (vzorky 1-4, tab. 3).U autoklávovaných vzorků jsou nové píky detekovány pouze v přítomnosti NaOH v roztoku a zdá se, že tvorba píku závisí na koncentraci NaOH v roztoku (vzorky 5-8, tabulka 3) (RRT = 0,79).Obrázek 5 ukazuje příklad iontového chromatogramu, který ukazuje dva autoklávované vzorky v přítomnosti nebo nepřítomnosti NAOH.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí.
Poznámka: Horní chromatogram: Vzorek byl ošetřen 0,1% vodným roztokem NaOH a autoklávován (120 °C po dobu 20 minut).Spodní chromatogram: Vzorek nebyl ošetřen NaOH, ale autoklávován za stejných podmínek.Hmotnostní konverze 203,30/129,10 Da (v pozitivním MRM módu) byla analyzována pomocí LC-MS.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí.
Ve všech autoklávovaných vzorcích, s nebo bez NaOH, byla koncentrace BDDE značně snížena (až 16,6krát) (vzorky 5-8, tabulka 2).Pokles koncentrace BDDE může být způsoben tím, že při vysokých teplotách může voda působit jako báze (nukleofil) k otevření epoxidového kruhu BDDE za vzniku 1,2-diolové sloučeniny.Monoizotopická kvalita této sloučeniny je odlišná od kvality BDDE, a proto nebude ovlivněna.LC-MS detekovala hmotnostní posun 203,30/129,10 Da.
Nakonec tyto experimenty ukazují, že generování nových píku závisí na přítomnosti BDDE, NAOH a procesu autoklávování, ale nemá nic společného s HA.
Nový pík nalezený při retenčním čase přibližně 2,71 minuty byl poté charakterizován pomocí LC-MS.Pro tento účel byl BDDE (9,9 mg/ml) inkubován v 1% vodném roztoku NaOH a autoklávován.V tabulce 4 jsou charakteristiky nového píku porovnány se známým referenčním píkem BDDE (doba retence přibližně 3,47 minuty).Na základě analýzy iontové fragmentace dvou píku lze dojít k závěru, že pík s retenčním časem 2,72 minuty vykazuje stejné fragmenty jako pík BDDE, ale s různou intenzitou (obrázek 6).Pro pík odpovídající retenčnímu času (PIS) 2,72 minuty byl pozorován intenzivnější pík po fragmentaci při hmotnosti 147 Da.Při koncentraci BDDE (9,9 mg/ml) použité při tomto stanovení byly po chromatografické separaci také pozorovány různé mody absorbance (UV, λ=200 nm) v ultrafialovém spektru (obrázek 7).Pík s retenčním časem 2,71 minuty je stále viditelný při 200 nm, zatímco pík BDDE nelze na chromatogramu za stejných podmínek pozorovat.
Tabulka 4 Charakterizační výsledky nového píku s retenčním časem asi 2,71 minuty a píku BDDE s retenčním časem 3,47 minut
Poznámka: K získání těchto výsledků byly na dvou pících provedeny analýzy LC-MS a HPLC (MRM a PIS).Pro HPLC analýzu se používá UV detekce s vlnovou délkou 200 nm.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;HPLC, vysokoúčinná kapalinová chromatografie;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí;m/z, poměr hmotnosti k náboji;PIS, produkt Iontové skenování;ultrafialové světlo, ultrafialové světlo.
Poznámka: Hmotnostní fragmenty se získají analýzou LC-MS (PIS).Horní chromatogram: hmotnostní spektrum fragmentů standardního vzorku BDDE.Spodní chromatogram: Hmotnostní spektrum nového detekovaného píku (RRT související s píkem BDDE je 0,79).BDDE byl zpracován v 1% roztoku NaOH a autoklávován.
Zkratky: BDDE, 1,4-butandioldiglycidylether;LC-MS, kapalinová chromatografie a hmotnostní spektrometrie;MRM, monitorování více reakcí;PIS, produktové iontové skenování;RRT, relativní retenční čas.
Obrázek 7 Iontový chromatogram prekurzorového iontu 203,30 Da a (A) nový pík s retenčním časem 2,71 minuty a (B) UV detekce píku referenčního standardu BDDE při 3,46 minutách při 200 nm.
U všech vyrobených zesíťovaných hydrogelů HA bylo pozorováno, že zbytková koncentrace BDDE po kvantifikaci LC-MS byla <2 ppm, ale v analýze se objevil nový neznámý pík.Tento nový vrchol neodpovídá standardnímu produktu BDDE.Standardní produkt BDDE také prošel konverzní analýzou stejné kvality (konverze MRM 203,30/129,10 Da) v pozitivním režimu MRM.Obecně se jako limitní testy k detekci BDDE v hydrogelech používají jiné analytické metody, jako je chromatografie, ale maximální detekční limit (LOD) je mírně nižší než 2 ppm.Na druhou stranu, NMR a MS byly dosud používány k charakterizaci stupně zesítění a/nebo modifikace HA ve fragmentech cukerných jednotek zesíťovaných produktů HA.Účelem těchto technik nikdy nebylo kvantifikovat zbytkovou detekci BDDE při tak nízkých koncentracích, jaké popisujeme v tomto článku (LOD naší metody LC-MS = 10 ppb).
Čas odeslání: září 01-2021